В настоящее время активно ведутся поисковые исследования новых биообъектов как источников биологически активных веществ. Это необходимо для того, чтобы получить продуценты, которые будут выгодны в культивировании, поддержании их жизнедеятельности и получении на выходе достаточного количества и высокого качества целевых продуктов. Одним из таких источников могут быть микро- и макроводоросли. Различные штаммы микроводоросли Chlorella являются объектами,
которые в последнее время привлекают внимание как коммерчески ценные источники широкого спектра соединений. Штаммы хлореллы имеют свои естественные
системы для борьбы с бактериями в водной среде.
Так, например, этанольный экстракт Chlorella minutissima был активен к S. aureus, E. coli, P. aeruginosa; водный, метанольный и гексановый экстракты Chlorella vulgaris оказывали воздействие на B. subtilis, S. epidermidis, S. typhi. Антимикробную активность экстрактов связывают с различными веществами, такими как жирные кислоты, фенольные соединения, пигменты, полисахариды, галогенированные углеводороды. Механизм антибактериального действия пигментов (каротиноиды, фикобилипротеины, производные хлорофилла), фенольных соединений (флавоноидов – рутин, кверцетин и кемпферол) и свободных жирных кислот (эйкозапентаеновая кислота, гексадекатриеновая кислота, докозагексаеновая кислота, пальмитолеиновая кислота) связан с их способностью разрушать клеточную стенку бактерий, а полисахаридов увеличивать проницаемость цитоплазматической мембраны. Несомненно, химическая структура биологически активных соединений водорослей отлична от современных антибиотиков, поэтому лекарственные препараты на основе микроводорослей могут оказаться эффективной альтернативой в терапии бактериальных инфекций.
Хлорелла отличается высокой скоростью роста и проявляет хорошо выраженные антагонистические свойства при плотности клеток в культуре более
10 млн/мл, гибель бактерий наступает через 6–10 часов культивирования. В связи с этим целью настоящего исследования является проведение фитохимического анализа
для подтверждения наличия широкого спектра БАС, а также исследований по выбору оптимальных параметров экстрагирования биомассы хлореллы
с целью получения экстрактов с высоким содержанием БАС, обладающих антибактериальным действием (пигменты, флавоноиды).
Объектом исследования являлась воздушно-сухая биомасса штамма Chlorella vulgaris Beyerinck ИФР C-2019, выращенная глубинным методом на среде Тамия. Влажность, фракционный состав, зольность, экстрактивные вещества определяли по ГФ ХIV, 2018. Протеин определяли методом Кьельдаля. Аминокислотный состав анализировали методом капельного электрофореза на системе капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ®-105M» (ООО «Люмэкс», Россия). Содержания жира – методом обезжиренного остатка в аппаратах Сокслета (в качестве экстрагента использовали петролейный эфир). Изучение жирно-кислотного состава проводили методом газожидкостной хроматографии после предварительного перевода жирных кислот в метиловые эфиры по методике ГОСТ 31665-2012 на газовом хроматографе «Кристалл 2000М» с капиллярной колонкой HP-FFAP длиной 50 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщиной фазы 0,50 мкм. Содержания фосфора – путем озоления по Пиневич в модификации Куркаева – спектрофотометрическим методом при длине волны 670 нм; кальций, цинк, железо – комплексонометрией; содержание клетчатки – методом по Геннебергу и
Штоману в модификации ЦИНАО [11]. Количественное содержание хлорофиллов, каротиноидов и флавоноидов проводили спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-201 (ЗАО «НПКФ Аквилон», Россия). Экстракты получали при температуре от 25 до 80 °С методом дробной мацерации. В качестве экстрагентов были использованы: вода очищенная и растворы этанола в концентрации от 30 до 95 %. Соотношение сырье – экстрагент от 1:5 до 1:100 (по массе). Дробную мацерацию проводили при перемешивании с использованием термостатируемого универсального шейкера LOIP LS-110 (ООО «Экрос-Аналитика», Россия), скорость вращения 170 об/мин. Статистическую обработку результатов исследования выполняли согласно ГФ XIV, вып. 1, ОФС.1.1.0013.15 [9].
В результате проведенного аминокислотного анализа белка биомассы хлореллы выявлены 14 аминокислот, в том числе незаменимые, содержащиеся в высоких концентрациях. Так же установлено, что биомасса хлореллы содержит 9 жирных кислот с преобладанием полиненасыщенных, основная масса которых приходится на линолевую (30,30 %), пальмитиновую (15,06 %) и пальмитолеиновую (18,78 %) кислоты. В золе биомассы хлореллы присутствуют, в значительных количествах, макро- и микроэлементы (фосфор, железо, кальций, цинк и др.). При проведении качественного анализа биомассы были обнаружены флавоноиды, каротиноиды и хлорофиллы
Согласно данным источников литературы, БАС хлореллы, обладающими антибактериальной активностью, являются флавоноиды и пигменты. Следовательно, при проведении исследований по подбору оптимальных параметров экстрагирования биомассы хлореллы целесообразно ориентироваться на данные группы веществ. На первом этапе исследования было изучено влияние степени измельчения на полноту экстракции сырья. В результате установлено, что измельчение альгомассы до 0,125–
0,160 мм способствовало полному извлечению БАС экстрагентом. Вторым этапом исследования являлось изучение влияния природы экстрагента на выход БАС и качественный состав экстракта. Проведенное сравнительное исследование показало, что больше всего экстрактивных веществ извлекается водой (29,83 %), суммы флавоноидов, каротиноидов и хлорофиллов – 90–95 %, спиртом – 0,56–0,83, 0,18–0,19 и 0,58–0,64 % соответственно.
Следующим этапом изучения оптимальных параметров экстракции было проведение эксперимента по определению оптимального соотношения сырье – экстрагент. Согласно данным эксперимента, оптимальным соотношением сырье – экстрагент явилось 1:50, при котором выход БАС, обладающих антибактериальным действием, из биомассы
хлореллы составил 72,83 ± 0,5 %. Затем были определены температурные параметры экстракции, обнаружено, что при повышении температуры экстракции с 25 до 80 °С увеличивается выход БАС в 3–4 раза, при этом время установления равновесия составляет 30–45 мин. При дальнейшем повышении температуры не наблюдалось увеличения
концентрации БАС. Заключительным этапом являлось определение кратности экстракции сырья. Многоступенчатая экстракция в течение 3 часов (трехкратная экстракция
этанолом в течение 60, 60, 60 мин при 80 °С) способствовала более полному извлечению БАС, при этом 65 % извлекается первой порцией экстрагента, 25 % второй и 10 % третьей. При дальнейшем увеличении продолжительности процесса содержание БАС в экстракте значительно не увеличивается.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенное фитохимическое исследование биомассы Chlorella vulgaris позволило выявить широкий спектр БАС. Биомасса хлореллы характеризуется высоким содержанием белка (64 %), аминокислот, в том числе незаменимых (12,27 %), жирных кислот (7 %) с преобладанием полиненасыщенных, основная масса которых приходится на линолевую (30,30 %), пальмитиновую (15,06 %) и пальмитолеиновую (18,78 %) кислоты, а также были обнаружены флавоноиды (1,56 %), каротиноиды (0,5 %) и хлорофиллы (1,96 %). В золе биомассы хлореллы С-2019 присутствуют, в значительных количествах, макро и микроэлементы (фосфор, железо, кальций, цинк и др.). Установлены оптимальные условия экстракции биомассы хлореллы при получении экстракта, содержащего высокие концентрации БАС: соотношение сырье – экстрагент (1:50), экстрагент спирт этиловый 95%-й, t экстракции 60–80 °С, трехкратная экстракция в течение 60, 60, 60 мин.
Таким образом, Chlorella vulgaris является перспективным лекарственным сырьем и может служить источником биологически активных соединений (белки, жирные кислоты, пигменты, фенольные соединения), используемых вмедицине и ветеринарии.
